黑茶發酵過程中酶的變化及影響因素

 黑茶發酵過程中酶的變化及影響因素

黑茶發酵過程中的“發酵”實際上包括兩個方面的層次，一是茶葉本身內源酶的作用，包括多酚氧化酶、過氧化氫酶等；二是微生物生長過程中形成的諸如澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、單寧酶等。

劉仲華等[27]運用聚丙烯凝膠電泳技術對黑毛茶初制過程中“渥堆”工序的多酚氧化酶譜進行分析，發現隨著渥堆時間的延續，酶帶不斷變化，產生與鮮葉不同的酶譜，而無菌渥堆的酶譜沒有新的酶帶產生，說明多酚氧化酶的同工酶組分來自於微生物的胞外酶；同時發現渥堆期間纖維素酶活性和果膠酶活性增加幅度較大，蛋白酶活性相對較低；渥堆中多酚氧化酶、纖維素酶和果膠酶活性與真菌類數量變化存在相當高的關聯性；酸性蛋白酶活性的高低僅與真菌類的黑麯黴有較強的關聯度。

黃建安等[28]運用酶分析技術研究了茯茶製造中多酚氧化酶同工酶、纖維素酶和果膠酶活性的變化，研究發現該3 種酶均存在於茯茶製造中，且在發花時呈現規律性的變化。添加誘發劑對發花中3種酶的活性有不同程度的增益效應，並且改變了多酚氧化酶同工酶譜及其活性，相應的同工酶提前出現，對改善茯茶的品質有積極的作用。何紅霞[29]對“散茶發花”過程微生物酶活性變化進行研究，發現散茶發花過程中的纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶以及單寧酶共六種酶的活力均由低到高變化且與微生物數量變化呈高度相關。蔡正安等[30]研究發現冠突散囊菌所產生的纖維素酶酶活性最佳溫度是50℃，最佳pH 值是4.8；在30~50℃，pH4~6 範圍內有較高的穩定性；Ca2+、Mg2+離子對酶活性有啟動作用，Mn2+、Zn2+、Pb2+離子對酶活有抑制作用。丁婷等[31]研究發現“金花”菌所產蛋白酶以中性和鹼性蛋白酶為主，最適碳源為乳糖，氮源為麩皮，最適無機鹽為氯化鈉；在此條件下“金花”菌產中性蛋白酶的酶活性可達到237 U/g，產鹼性蛋白酶的酶活性可達236U/g。而有關發酵後功能性發生變化如抗氧化活性、增強防止脈粥樣硬化能力、抗菌及抗腫瘤作用等不再重複。

代謝組學在研究發酵產品中的應用研究

發酵產品核心是微生物及其酶的作用，當然也包括特定的工藝，這和傳統釀造食品非常類似。由於傳統發酵食品的微生物群落的多樣性，發酵食品的生產過程涉及物理、化學甚至生物學之間的交互性，代謝產物的複雜性，發酵環境的多變性，實際上研究傳統發酵食品各種變化很難達到一定的高度，於是代謝組學應運而生使得對複雜發酵過程的系統分析或控制成為可能。代謝組學（Metabolomics）是以定性和定量限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分為目標，以系統生物學的觀點集中闡釋生物體代謝反映的全部資訊，為發現生物標誌物、進一步闡明機理提供了新的方法和思路。所以代謝組學比傳統單一指標的檢驗分析方法更具系統性。同時高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC MS/MS）和高效液相色譜-核磁共振聯用技術（HPLC NMR）相結合能在未獲得未知化合物純品的情況下，得到未知化合物的UV、NMR、MS 資訊，為未知化合物分析提供了全面的資訊。

代謝組學在傳統發酵食品研究中發揮重要的作用。Himmelreich 等[32]應用13C NMR 技術對釀酒酵母代謝物進行分析，發現了甘氨酸分解代謝新途徑。Choi 等[33]以HNMR 技術為基礎，利用代謝組學研究方法對韓國豆醬的生產過程進行了即時檢測，通過結合主成分分析確定發酵過程中糖含量下降，乙酸、酪氨酸、苯丙氨酸等含量增加主要是發酵時間不同所致。Weckx S 等[34]研究了黑麥在10 d內3個階段的自然發酵過程中菌相和組分的變化情況，利用非靶標技術發現了在發酵過程各階段可能與一些微生物活動相關的標記物。梁恒宇[35]對5 株釀酒酵母分別進行葡萄酒發酵試驗，利用基於NMR 和氣相色譜-質譜聯用（GC MS）的代謝組學技術監控發酵過程，發現葡萄酒釀造過程可明顯分為3 個階段，並得到其不同階段各菌株所釀葡萄酒組分差異的主要標記物，為葡萄酒釀造工藝調控提供了理論方向。LeVan Diep [36]利用基於NMR 和GC MS 的代謝組學技術對汾酒大麯培養過程中各階段的代謝組分進行了跟蹤監測，揭示了清香型大麯（汾酒大麯）培養過程中各階段大麯中的標記物，且各培養階段可用乙酸、丙氨酸、精氨酸、甜菜堿、膽鹼、乙醇、果糖、葡萄糖、乳酸、甘露醇等標記物來區分，揮發性香氣成分也有類似的規律，該研究為傳統發酵食品的程序控制提供了理論基礎。

另外，發酵食品的產物具有不確定性，微生物種類及微生物生態複雜變化，不同發酵階段微生物不同，酶系分析不同，代謝產物差異很大。值得一提的是：微生物多樣性，微生物之間協同拮抗等多重作用，主要代謝產物包括主要成分轉化和風味形成極其複雜，因此採用現代技術分析代謝過程中代謝產物很有必要。利用HPLC-NMR、HPLC-MS、ESI、 MS/MS、LCQ等多種現代分析技術有機結合去鑒定降解產物或新形成產物，再去探求其合成途徑，探求底物、微生物酶、反應條件的相關性，這是下一步研究的重要方向。劉仲華教授鑒定茯茶素1和茯茶素2，證明已經在這方面取得成功的經驗， 傅冬和[37]通過綜合運用柱色譜、紅外、紫外、質譜、核磁共振、高效薄層及高效液相色譜等技術手段，從茯茶中分離確定8 個化合物分別為：沒食子酸、沒食子兒茶素(GC)、3-甲氧基-4,5-二輕基苯甲酸、3,4-二輕基苯甲酸、表沒食子酸兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)及蘆丁。Ling 等[38]通過傳統分離純化技術手段結合紅外、核磁、液質聯用等從茯茶中分離鑒定了3 個新的萜烯類化合物。Lee 等[39]通過基於核磁共振（1H NMR）和主成分分析（PCA）的代謝組學方法研究了綠茶發酵過程中茶葉內含成分的變化，揭示了綠茶發酵過程中與發酵成熟相關的14 種標記物，為研究綠茶的發酵過程調控提供了可靠的理論基礎。茯磚茶是一種很好的發酵產品，採用代謝組學進行研究是非常必要的和有效的。

存在的問題與下一步研究發展的方向

建立茯磚茶發酵體系的優勢微生物資源庫：從已經研究得到的結果來看，黑茶發酵過程中存在大量的有益微生物，對黑茶功能活性成分增加起到非常重要的作用。資源庫的建立可以有利於探索黑茶發酵過程中進行微生態的動態變化規律，探索各微生物的作用機理和功能，區分其有益還是需要控制的微生物等等，同時動態發酵過程也是微生物彼消我長的過程，對發酵過程中微生物變化和物質變化聯繫起來進行控制，可為生產產品品質安全控制和鑒定提供重要依據。同時資源庫的建立有利於有效保障產品的特異性和差異性。

建立以純種發酵為主的現代發酵技術改良傳統“發花”工藝：優勢微生物對茯磚茶品質形成具有決定性作用，為進一步提升黑茶產品的技術含量和核心競爭力，確保優勢微生物最佳發酵轉化條件，建立多菌種混合發酵的穩態化發酵技術體系，保障產品品質和安全。強調利用現代生物技術改良傳統生產工藝不是一味求所謂“快速發酵”，但求品質穩定和安全；也可以根據區域優勢微生物不同，形成產品品質差異化，尋求健康有序發展。

利用代謝組學進一步研究發酵過程中主要核心物質的動態變化：採用HPLC MS/MS 和HLC NMR 聯用技術對發酵前後茶葉化學組成變化進行分析，篩選發酵前後茶葉樣品的差異代謝物，明確特徵代謝物的底物來源及可能的生物合成途徑，以期探明茯茶中冠突散囊菌作用下的代謝物變化及其形成機理。同時將有效轉化產物進行生理活性鑒定，構建茶葉基礎上新物質的結構-功能的構效關係，為進一步開發更高附加值的茶產品奠定堅實的物質基礎和理論基礎。

形成特色的區域資源優勢和技術內涵：安化黑茶有其獨特的發展歷史和資源優勢、地域優勢、加工區域優勢，俗話說“一方水土養一方人”，要使產業實現可持續發展，強化對本地資源優勢的保護是十分必要的，如茶葉品種的原地產保護、自然環境中天然野生茶資源的開發，同時將微生物資源、特色加工工藝和冰漬岩等地理地質條件聯繫起來，形成獨特的區域性極強的文化特色和消費特色、地域特色，形成安化黑茶特有的文化技術內涵，提升安化黑茶品味，這將有十分重要的戰略意義。